Riwayat hidup Barnabas dapat ditemukan di dalam Kisah Rasul bab 4, 9, 11, 13 dan 15. Ia berasal dari Siprus, keturunan bangsa Yahudi dari suku Lewi. Ia bersedia menerima nama baru “Barnabas” (Putera Penghiburan) yang diberikan para rasul sebagai pengganti nama aslinya, Yosef. Ia dikenal luas karena hubungannya dengan Paulus. Barnabaslah yang menghantar Paulus kepada para Rasul untuk menceritakan peristiwa penampakan Tuhan pada Paulus di tengah perjalanannya ke Damsyik untuk menangkap orang-orang Kristen disana. Ia-lah yang menyakinkan para rasul tentang kehidupan baru Paulus setelah peristiwa penampakan Tuhan itu. Keberanian Paulus mengajar di Damsyik dalam nama Yesus juga dijelaskan kepada mereka.

Ketika terdengar berita bahwa di Antiokia sudah banyak orang bertobat dan percaya kepada Yesus, maka para pemimpin Yerusalem mengutus Barnabas kesana untuk melayani mereka. Di Antiokia Barnabas mengajar umat tentang Kristus yang hidup dan meneguhkan mereka dengan teladan hidupnya yang saleh. Selama berada disana, ia berhasil mempertobatkan banyak orang lagi dan selalu meminta mereka agar tetap setia kepada Tuhan. Setelah itu ia pergi ke Tarsus untuk menemui Paulus. Setelah bersua dengan Paulus, mereka kembali ke Antiokia. Suatu ketika, Roh Kudus menaungi mereka dan bersabda: “Khususkanlah Barnabas dan Paulus bakiKu untuk tugas yang telah Kutentukan bagi mereka!” Setelah berpuasa dan berdoa, mereka meletakkan tangan ke atas kedua orang itu dan membiarkan mereka pergi. Dari sana mereka berlayar ke Siprus. Setibanya di Salamis, mereka mewartakan Sabda Tuhan dalam rumah ibadat Yahudi. Yohanes Markus membantu mereka.

Dalam misi pertama penyebaran Injil di Asia kecil itu, mereka mempertobatkan banyak orang. Tetapi sebaliknya mereka pun mengalami banyak penderitaan demi Injil Kristus. Karena umat baru dari bangsa-bangsa bukan Yahudi itu dirisaukan oleh anggota-anggota umat yang dipimpin Yakobus, maka umat Antiokia mengutus Barnabas dan Paulus ke Konsili Yerusalem (tahun 49 / 50). Konsili ini menetapkan syarat penerimaan orang kafir ke dalam pangkuan Gereja tanpa harus menjalani aturan hukum Taurat. Setelah perkara itu tuntas, Paulus mengajukan usul kepada Barnabas: “Mari kita mengunjungi saudara-saudara di semua kota, dimana kita telah menaburkan benih Sabda Tuhan, untuk melihat keadaan mereka.” Barnabas setuju dan membawa serta orang yang dahulu telah meninggalkan mereka di Pemfilia. Hal ini menjadi pangkal perselisihan antara mereka berdua. Barnabas membawa Markus berlayar ke Siprus.
Barnabas kemudian menemui ajalnya setelah dirajam oleh orang-orang Yahudi di Salamis. Karena karya dan jasanya, Barnabas dimasukkan dalam bilangan para pendiri Gereja dan dianggap sebagai seorang Rasul. Mungkin Barnabaslah yang menulis surat kepada umat di Ibrani yang terdapat di dalam Kitab Suci Perjanjian Baru. Suatu karya pemalsuan oleh seorang Kristen yang murtad menjadi Islam pada abad ke-14 disebut Injil Barnabas, walaupun pasti bukan karya Barnabas.